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    免疫沉淀(IP)裂解液和試劑

    更新時間:2024-04-15      點擊次數:777

    免疫沉淀是一種能夠純化蛋白質的方法。將目標蛋白質的抗體與細胞提取物一起孵育,抗體會與溶液中的蛋白質結合。通過使用蛋白A/G偶聯的瓊脂糖珠將抗體/抗原復合物從樣品中提取出來 。這可以將目標蛋白質與樣品的其余部分分離。然后通過SDS-PAGE分離樣品進行蛋白質印跡分析。


    裂解緩沖液


    理想的裂解緩沖液將最大限度地減少蛋白質變性,同時從樣品中釋放足夠量的蛋白質。NP-40和Triton X-100等非離子型去污劑的刺激性低于SDS和脫氧膽酸鈉等離子型去污劑。其他可能影響免疫沉淀成功的變量包括了鹽濃度、二價陽離子濃度和pH值等。為了優化變量,應在以下范圍內測試它們:


    -鹽:0-1 M


    -非離子洗滌劑:0.1-2%


    -離子洗滌劑:0.01-0.5%


    -二價陽離子:0-10 mM


    -EDTA:0-5 mM


    -酸堿度:6-9


    非變性裂解緩沖液


    用于可溶于去污劑且可被抗體以天然形式識別的抗原。Triton X-100可以替代NP-40。


    -20 mM Tris HCl pH 8


    -137 mM 氯化鈉


    -1% Nonidet P-40 (NP-40)


    -2 mM EDTA


    4°C下最多可保存6個月,使用前立即添加蛋白酶抑制劑。


    為方便起見可配制10%脫氧膽酸鈉儲備液(5g加入50mL),必須避光。


    不含去垢劑的可溶性蛋白裂解緩沖液


    一些可溶性蛋白質可能不需要使用洗滌劑。此緩沖液用于機械細胞裂解,例如使用杜恩斯勻漿器進行勻漿。


    PBS含有:


    -5mM EDTA




    4°C下最多可保存6個月,使用前立即添加蛋白酶抑制劑。


    非去污劑可溶性抗原的變性裂解緩沖液


    僅識別變性蛋白質的抗體無法接近天然蛋白質的表位。收獲和裂解細胞時,在變性裂解緩沖液中加熱細胞。該方法也可用于無法用非離子去污劑從細胞中提取的抗原。使用蛋白酶抑制劑將有助于從染色質中提取蛋白質。


    1% SDS


    5mM EDTA


    室溫下最多可保存1周。


    使用前立即添加


    10 mM二硫蘇糖醇或β-巰基乙醇


    蛋白酶抑制劑15 U/mL


    洗滌緩沖液


    -10mM Tris;調節pH至7.4


    -1mM EDTA


    -1mM EGTA;pH8.0


    -150mM氯化鈉


    -1% Triton X-100


    -0.2mM原釩酸鈉


    -蛋白酶抑制劑混合物


    4°C下最多可保存6個月。使用前立即添加蛋白酶抑制劑。


    其他試劑


    蛋白酶抑制劑


    細胞裂解后,蛋白水解、去磷酸化和變性過程就開始了。將樣品放在冰上會減慢這些過程,但也可以使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物。如果不使用混合物,PMSF(50 μg/mL)和抑肽酶(1 μg/mL)是常用于免疫沉淀的蛋白酶抑制劑。


    其他試劑


    -無菌PBS pH 7.4


    -無菌PBS-BSA 1% w/v(過濾)


    -TBST緩沖液


    -用于蛋白質印跡的上樣/樣品緩沖液


    -VeriBlot用于免疫沉淀二抗,在蛋白質印跡過程中優先檢測未還原、未變性 的一抗。


    -100mM EDTA庫存溶液由1.86gEDTA溶解在40mL H2O中制成。添加NaOH 將pH調節至7.4。最后將總體積調整至50 mL。


    制備裂解物


    細胞培養物裂解物(非變性)


    1,將細胞培養皿置于冰上,并用冰冷的PBS清洗細胞。


    2,排干PBS,然后添加冰冷的裂解緩沖液(1mL每107個細胞/100mm2培養皿 /150cm2燒瓶;0.5 mL每5×106個細胞/60mm2培養皿或75cm2燒瓶)。


    3,使用冷塑料細胞刮刀將貼壁細胞從培養皿上刮下,然后將細胞懸浮液輕輕轉 移至預冷的微量離心管中。


    4,在4°C下保持恒定攪拌30分鐘。


    5,在4°C的微量離心機中離心。


    您可能需要根據細胞類型改變離心力和時間。原則是12,000 rpm,20分鐘, 但您應該針對您的特定實驗進行優化(例如,白細胞需要非常輕微的離心)。


    6,輕輕地從離心機中取出管子并置于冰上。吸出上清液并置于冰上的新管中, 并丟棄沉淀。 


    細胞培養物裂解物(變性)


    1,將100μL變性裂解緩沖液添加到0.5-2×107個細胞中。


    2,以最大速度劇烈渦旋2-3秒充分混合。將細胞懸液轉移至微量離心管中。由 于DNA的釋放,溶液在此階段可能會變得粘稠。


    3,將樣品加熱至95°C,5分鐘使其變性。


    4,用0.9 mL非變性裂解緩沖液稀釋懸浮液,輕輕混合。


    非變性裂解緩沖液中過量1% Triton X-100會淬滅原始變性緩沖液中的SDS。


    5,將裂解的懸浮液通過連接到1 mL注射器的針頭5-10次,從而打碎DNA。


    通過重復機械破壞,直到粘度降低。如果 DNA存在消化和片段化, 可能會干擾離心后沉淀與上清液的分離。


    6,在冰上孵育5分鐘。


    7,繼續進行免疫沉淀。


    組織裂解物


    1,用干凈的工具盡快解剖組織。如果可能,請在冰上進行以防止蛋白酶降解。


    2,將組織放入圓底微量離心管中,浸入液氮中快速冷凍。將樣品儲存在-80°C 下供以后使用或保存在冰上以便立即均質化。


    3,對于約5 mg的組織片,將約300 μL裂解緩沖液快速添加到管中,并用電動 勻漿器勻漿。


    4,每次沖洗時用另外300 μL裂解緩沖液沖洗刀片兩次,然后在4°C下保持恒 定攪拌2小時(例如置于冰箱中的定軌搖床上)。


    裂解緩沖液的體積必須根據存在的組織量來確定。蛋白質提取物不應太稀,以避免蛋白質損失并盡量減少上樣到凝膠上的樣品體積。濃度0.1mg/mL;最佳濃度為1–5mg/mL。


    如果需要變性樣品,使用變性裂解緩沖液并執行上述變性方案中的步驟2-5。


    5,在微量離心機中于4°C下以12,000 rpm離心20分鐘。輕輕地將管從離心機 中取出并置于冰上,吸出上清液并置于冰上保存的新管中丟棄沉淀。


    預清除裂解物


    預清除裂解物有助于減少非特異性結合并降低背景。但如果蛋白質的最終檢測是通過蛋白質印跡法進行,則不需要預清除,除非污染蛋白質干擾了目標蛋白質的可視化。


    1,將50 μL與免疫沉淀抗體相同種類和同種型的脫靶抗體或正常血清(通常優先選擇兔)添加到1 mL裂解液中。在冰上孵育1小時。


    2,將100 μL珠漿添加到裂解液中。


    3,在 4°C下孵育10–30分鐘,并輕輕攪拌。


    4,在微量離心機中于4°C以14,000 g旋轉10分鐘。


    5,丟棄珠粒并保留上清液用于免疫沉淀。


    為了提高產量,可以在裂解緩沖液中將珠子洗滌1或2次以上,并將上清液 收集在一起。


     


     


    重要的是要確保盡可能多地去除正常血清。為了確保這一點,可以使用裂解緩沖液代替樣品進行測試,并執行上述所有預清除步驟。


    將所得上清液進行凝膠電泳并用考馬斯染色顯示血清Ig是否被有效去除。如果血清未充分去除,重鏈和輕鏈將出現50和25kDa的條帶;它的存在可能會導致免疫沉淀反應較弱??紤]減少血清量或增加預澄清步驟中與樣品一起孵育的珠子量。


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